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天凈沙 可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒

  • 型   號(hào):211216-100
  • 價(jià)   格:
  • 更新時(shí)間:2024-11-08
  • 廠家性質(zhì):經(jīng)銷商

211216-100 天凈沙 可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒,產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
產(chǎn)品品牌:天凈沙
產(chǎn)品名稱:可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒
產(chǎn)品貨號(hào):211216-100
產(chǎn)品規(guī)格:100次

天凈沙211216-100可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒

北京天凈沙基因科技有限公司,是一家聚焦科研試劑、動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫、分子診斷的研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)。


211216-100 天凈沙 可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒,產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

產(chǎn)品品牌:天凈沙

產(chǎn)品名稱:可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒

產(chǎn)品貨號(hào):211216-100

產(chǎn)品規(guī)格:100

211216-100 天凈沙 可調(diào)式易錯(cuò) PCR 試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)

易錯(cuò)PCRError-prone PCR)是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校對(duì)功能的特性,在一定條件下(如不同的dNTP濃度、Mg濃度和MnCl2存在)能夠按較高的機(jī)率引入隨機(jī)引入突變。如果有適當(dāng)?shù)倪x擇方法,則可從構(gòu)建的突變庫選出所需突變體。本產(chǎn)品是在本公司的易錯(cuò)PCR試劑盒的基礎(chǔ)上改進(jìn)而得,本

產(chǎn)品具有下列特點(diǎn):

1. 即開即用,十分簡(jiǎn)單方便,尤其在生物制藥和酶學(xué)研究領(lǐng)域顯示出了它的*性。

2. 配方經(jīng)過精心優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)人員在一定范圍內(nèi)可以控制突變率,一輪PCR的突變率范圍在2-8突變/1000bp,更高的突變率可以通過多輪PCR達(dá)到。

3. 可用于連續(xù)易錯(cuò)PCRsequential error-prone PCR),只需把上一次易錯(cuò)PCR的產(chǎn)物用作下一次易錯(cuò)PCR的模板即可,使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。

4. 可以擴(kuò)增的DNA片段更長,達(dá)到2kb,對(duì)于2kb以上的產(chǎn)物,建議分段擴(kuò)增。

5. 本試劑盒足夠10030uL體系的易錯(cuò)PCR。

6. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

本產(chǎn)品采用五孔盒包裝

成份

編號(hào)

規(guī)格

包裝材料

可調(diào)易錯(cuò)PCR專用 Taq DNA聚合酶(5U/uL

101005c

50   uL

0.5mL紅蓋管

5×可調(diào)易錯(cuò)PCR Mix(含dNTP

211216a

600   uL

0.5mL黃蓋管

可調(diào)易錯(cuò)PCR專用MnCl2

211216c

300   uL

0.5mL紫蓋管

可調(diào)易錯(cuò)PCR專用dGTP

211216d

300   uL

0.5mL藍(lán)蓋管

10×可調(diào)易錯(cuò)PCR追加dNTP

211216e

300   uL

0.5mL本色管

使用手冊(cè)

211216sc

1

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸,-20℃保存, 有效期為一年

自備試劑

引物、DNA模板、常規(guī)PCR試劑盒

使用方法

1. 將引物稀釋到10uM。引物也是決定易錯(cuò)PCR成敗的關(guān)鍵因素,設(shè)計(jì)引物時(shí)要保證其Tm70℃,長度在25-30nt之間,GC含量在45%-60%之間,3GC含量低,并且沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

2. 用自備易錯(cuò)PCR引物和自備的常規(guī)PCR試劑擴(kuò)增制備易錯(cuò)DNA模板(常規(guī)PCR產(chǎn)物),膠回收并準(zhǔn)確確定濃度。注意:易錯(cuò)PCR的模板一定要用膠回收的常規(guī)PCR產(chǎn)物,因?yàn)槟z回收會(huì)可以把電泳不可見的非特異性擴(kuò)增片段去除,否則這些片段由于也是用易錯(cuò)PCR引物擴(kuò)增所得,在易錯(cuò)PCR擴(kuò)增時(shí)也會(huì)被擴(kuò)增,產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制,降低靶分子的擴(kuò)增效率。

3. 將回收的DNA片段(模板)稀釋到1ng/uL 、10ng/uL100ng/uL三個(gè)濃度。注意:模板使用量是影響突變率的最重要因素,模板DNA為非突變DNA,擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA為突變DNA,易錯(cuò)PCR體系最終DNA量是基本固定的,因此模板DNA使用量越大,則突變DNA在終產(chǎn)物中的相對(duì)比例就越低,突變率就越低。故建議同時(shí)測(cè)試三個(gè)模板用量。如果都成功,則優(yōu)先選用模板濃度低的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

4. 根據(jù)每1000bp的預(yù)期突變數(shù)按下表確定30uL易錯(cuò)PCR體系中MnCl2dGTP的用量(這是在模板DNA不超過1ng的前提下的數(shù)據(jù))。表中的Mn表示可調(diào)易錯(cuò)PCR專用的MnCl2, dG表示可調(diào)易錯(cuò)PCR專用的dGTP

預(yù)期突變數(shù)

2個(gè)

3個(gè)

4個(gè)

5個(gè)

6個(gè)

7個(gè)

8個(gè)

Mn用量(uL

0

1.0

2.5

4.0

4.0

4.0

4.0

dG用量(uL

0

0

0

1.0

2.0

3.0

4.0

5. 設(shè)置30uL體系的可調(diào)易錯(cuò)PCR:第一次建議設(shè)置3個(gè)模板濃度。在3干凈的PCR管中,分別加入下列成分。最后加可調(diào)易錯(cuò)PCR專用MnCl2

成分

模板用量1

模板用量2

模板用量3

可調(diào)易錯(cuò)PCR   Mix, 5×

6   uL

6   uL

6   uL

可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用dGTP

根據(jù)上步用量表表選擇

根據(jù)上步用量表表選擇

根據(jù)上步用量表表選擇

自備DNA模板

1   uL 1ng/uL

1   uL 1ng/uL

1   uL 1ng/uL

自備PCR引物 (10 uM each)

1   uL each

1   uL each

1   uL each

可調(diào)易錯(cuò)PCR專用 Taq DNA聚合酶

0.5   uL

0.5   uL

0.5   uL

可調(diào)易錯(cuò)PCR 專用MnCl2

根據(jù)上步用量表表選擇

根據(jù)上步用量表表選擇

根據(jù)上步用量表表選擇

自備超純水

補(bǔ)水到30uL

補(bǔ)水到30uL

補(bǔ)水到30uL

6. 按已經(jīng)優(yōu)化的常規(guī)PCR條件進(jìn)行易錯(cuò)PCR

PCR前變性

94 3分鐘

易錯(cuò)PCR(循環(huán)30-60

94 1分鐘

60 1分鐘

72 3-10分鐘

注:由于易錯(cuò)PCR含高濃度的鎂離子,因此容易形成引物二聚體,因此需要使用較高的復(fù)性溫度,以避免小片段擴(kuò)增產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)性抑制PCR。易錯(cuò)PCR一般不需要熱啟動(dòng),也不需要在易錯(cuò)PCR結(jié)束后做延伸處理。易錯(cuò)PCR循環(huán)次數(shù)越多,突變DNA(擴(kuò)增產(chǎn)物)與非突變DNA(原始模板)的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下,擴(kuò)增次數(shù)越多,發(fā)生突變的絕對(duì)數(shù)就越高,在同一模板上發(fā)生的突變位點(diǎn)數(shù)就越多,所以如果需要,可以做30、35、40、45、50、55、607個(gè)循環(huán)數(shù)的比較

7. 易錯(cuò)PCR結(jié)束后,取3uL進(jìn)行電泳檢查。

8. 如果有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物,則全部電泳,進(jìn)行膠回收,再進(jìn)行克隆和測(cè)序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率,可以選擇一個(gè)突變后的DNA為模板,再進(jìn)行下一輪易錯(cuò)PCR。

9. 如果沒有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物,可以按下列操作追加進(jìn)行一輪常規(guī)PCR(追加PCR)。

10. PCR管中,加入3uL 10×可調(diào)易錯(cuò)PCR專用追加dNTP27uL電泳剩下的PCR體系中,按下表進(jìn)行追加PCRchasing PCR)。注意追加PCR只做20次循環(huán)。

步驟

參數(shù)

循環(huán)數(shù)

追加PCR

94 1分鐘

循環(huán)20

60 1分鐘

72 1分鐘

11. 追加PCR結(jié)束后,再電泳檢測(cè)。如果有條帶,再進(jìn)行克隆和測(cè)序等后續(xù)操作。如果需要增加突變率,可以選擇一個(gè)突變后的DNA為模板,再進(jìn)行下一輪易錯(cuò)PCR

12. 如果沒有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物,則需要分析原因

疑難解答

Q:現(xiàn)象:沒有PCR產(chǎn)物。

A:可能原因:一是引物沒有優(yōu)化,可以重新設(shè)計(jì)引物;二是模板DNA太少,可以增加用量;三是模板不純,最好先膠回收;四是DNA溶液中有EDTA,可以適當(dāng)補(bǔ)加Mg++。

Q:現(xiàn)象:太多的PCR條帶或PCR條帶模糊一片。

A:可能原因:一是模板有膠回收、二是PCR循環(huán)數(shù)太多;三是復(fù)性溫度太低;四是引物沒有優(yōu)化;五是PCR條件沒優(yōu)化,可以使用touch-down PCR

Q: 如果需要更高的突變率,如何辦?

A: 可以使用連續(xù)多次易錯(cuò)PCR來提高突變率。但最好先用膠純化回收易錯(cuò)PCR片段,再用于下一輪易錯(cuò)PCR。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

易錯(cuò)PCR試劑盒



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